Davide Borroni
Metagenomica: un curioso investigatore al servizio dei nostri occhi
Il corpo umano è popolato da un’enorme varietà di batteri, archaea, funghi e virus che formano una comunità commensale, simbiotica e patogena nota come microbioma umano. Il numero stimato di microrganismi è dell’ordine di trilioni, almeno 10 volte superiore al numero delle cellule di un corpo umano. Molte tecnologie
sono state applicate per studiare il microbioma e la più recente ed avanzata si chiama metagenomica. Si riferisce all’analisi delle popolazioni di microrganismi basata sullo sviluppo della tecnologia di sequenziamento di nuova generazione (NGS), una macchina in grado di leggere il DNA ed interpretare i dati ottenuti.
L’applicazione di NGS consente la lettura da migliaia a milioni di segmenti di acido nucleico (le piccole parti di cui è composto un microrganismo) contemporaneamente in un singolo momento. Consente quindi di decodificare importanti genomi di grandi dimensioni, come il genoma umano e dei microbi. NGS applicata nello studio di un campione microbiologico (le analisi che un medico fa per capire se c’è un’infezione) consente di capire e studiare la completa profilazione tassonomica (“chi è?”) e il confronto delle funzioni (“cosa sta facendo?”) di comunità microbiche di diverse aree che creano l’infezione potenzialmente molto dannosa per il nostro corpo, in un breve lasso di tempo rispetto alle analisi standard.
Traslato in oculistica NGS ha importanti applicazioni cliniche in diverse aree e specialmente nelle infezioni oculari ed ovunque sia ipotizzabile la presenza di un microbo. Nel settore dei trapianti di cornea è ben noto che le cornee dei donatori possono essere fonte di contaminazione in quanto contengono cellule vitali e come tali non possono subire i tipici processi di sterilizzazione che danneggerebbero anche le cellule sane da trapiantare.
I fattori di rischio per lo sviluppo di un’infezione a seguito di un trapianto di cornea includono il trattamento immunosoppressivo dopo l’intervento chirurgico, l’erroneo uso dei colliri e lo stato avascolare della cornea.
L’avascolarità corneale impedisce sì l’arrivo del sangue con le sue proprietà anti-infettive ma permette la trasparenza del tessuto e quindi di vedere in modo chiaro. Nel nostro studio abbiamo analizzato se ci sono patogeni presenti nei vari tipi di liquidi di conservazione dei tessuti corneali che non vengono rilevati utilizzando le analisi standard ma potrebbero potenzialmente complicare un trapianto di cornea con gravi conseguenze sul paziente. Questo ci permette di studiare “al massimo della potenza” la tecnologia NGS, vedendo se un tessuto considerato sterile contiene in realtà dei patogeni potenzialmente dannosi. Le cornee di donatori umani sono state ottenute dalla Fondazione Banca degli Occhi del Veneto con il consenso scritto del parente più prossimo del donatore per essere utilizzate a fini di ricerca. Lo studio ha seguito i Principi della Dichiarazione di Helsinki del 2013. Le cornee dei donatori umani sono state asportate, conservate e il DNA è stato isolato dai liquidi di conservazione. Sono state eseguite analisi specifiche necessarie per applicare la tecnologia NGS, come la amplificazione con la generazione combinata di ampliconi più la preparazione della libreria per il sequenziamento.
Passaggi complicati ma che con adeguata standardizzazione risultano semplificati e facilmente eseguibili. I dati sono stati elaborati utilizzando software dedicati per poter leggere le informazioni ottenute e rendere comprensibili i dati. I risultati hanno mostrato una minima presenza di Pseudomonas, Comamonas, Stenotrophomonas, Alcanivorax spp. e Brevundimonas. Tutti i campioni, inclusi i controlli, hanno mostrato invece risultati negativi nelle analisi standard. Ulteriori analisi dei tessuti corneali con tecnologia Shot-Gun capace di capire se il DNA trovato corrisponde a un patogeno che è vivo oppure no, hanno fortunatamente dimostrato che i patogeni non erano attivi, quindi non in grado di produrre proteine e creare un’infezione.
Come punto importante, per la prima volta siamo stati in grado di trovare “qualcosa” dove le analisi standard hanno trovato “nulla” ma che potrebbe essere una potenziale fonte di infezione. La tecnologia NGS è stata quindi più “precisa” dei metodi standard. Il sequenziamento metagenomico ha il potenziale per migliorare l’analisi microbiologica dei campioni a partire da basse concentrazioni, anche in campioni considerati sterili dagli attuali metodi di analisi. Nel prossimo futuro gli oculisti avranno la possibilità di avere la quantificazione precisa, tipizzazione e sequenza genetica del microbioma di campioni oculari senza i problemi associati ai test standard. Date le attuali tendenze nello sviluppo della tecnologia genomica, è probabile che i costi si riducano in modo significativo e si potranno ottenere risultati standardizzati in tempi ridotti. Con personale adeguato attualmente il protocollo finale può essere completato in meno di 48 ore.