Diletta Francesca Squarzanti
Le oncoproteine E6 e E7 di HPV16 interagiscono con la proteina cellulare 53BP1 in un modello tridimensionale in vitro
I Papilloma virus umani (HPV) infettano gli epiteli squamosi pluristratificati e sono responsabili dell’insorgenza dei tumori ano-genitali e di altri siti anatomici.
Nonostante le misure di prevenzione, rappresentate anche dai vaccini a nostra disposizione, queste neoplasie rappresentano ancora il quarto tumore al mondo e la seconda causa di morte tra le donne.
L’infezione da HPV, in particolar modo quella promossa dai genotipi ad alto rischio di trasformazione 16 e 18, è basata sull’espressione delle oncoproteine virali, tra cui E6 ed E7, le quali cooperano durante la trasformazione maligna delle cellule.
E6 è in grado di legare e degradare la proteina oncosoppressore p53, mentre E7 di inattivare la proteina pRb; entrambe le proteine cellulari p53 e pRb sono necessarie per impedire al tumore di instaurarsi e di progredire.
Durante l’infezione, la cellula ospite subisce dei danni alla sua doppia elica di DNA ed attiva di conseguenza dei meccanismi di riparo, continuando comunque a proliferare.
Questi eventi sono caratteristici dell’infezione da HPV e non sono riscontrabili per altri tipi di virus a DNA, i quali invece inducono un arresto della crescita cellulare simultaneo alla riparazione del danno al DNA.
Per delucidare quali meccanismi molecolari siano alla base di questo processo, abbiamo allestito delle colture tridimensionali (3D) in vitro che riproducono ciò che avviene negli epiteli infettati: esse sono costituite da cellule che esprimono le oncoproteine virali e consentono di mimare la condizione in vivo senza ricorrere all’uso di modelli animali.
In questo lavoro abbiamo analizzato sia le molecole prodotte dal virus sia quelle proprie delle cellule ospiti infettate.
Attraverso una tecnologia di ibridazione effettuata sui tessuti ricostruiti in laboratorio abbiamo potuto riscontrare la presenza del genoma virale.
Con immagini di immunofluorescenza abbiamo evidenziato l’espressione delle oncoproteine virali E6 ed E7. Inoltre abbiamo evidenziato diversi marcatori di proliferazione cellulare e dimostrato l’attivazione di due veri e propri sensori del danno al DNA cellulare indotto dagli HPV, denominati 53BP1 e γH2A.X.
Dal momento che anche 53BP1, come E6 ed E7, è in grado di legare p53 e pRb, abbiamo ipotizzato che potesse avvenire un legame diretto anche tra queste molecole.
Per dimostrarlo, abbiamo utilizzato l’innovativa tecnica PLA, la quale consente di determinare con un’elevata sensibilità e specificità le interazioni tra singole proteine con una risoluzione di 40 nm direttamente nel contesto del tessuto e dei singoli compartimenti cellulari, rendendole visibili sotto forma di singoli puntini fluorescenti colorati.
L’epitelio 3D ricostruito in vitro si è ancora una volta rivelato, come già precedentemente dimostrato da altri studi, lo strumento ideale per studiare la vita del virus all’interno delle cellule ospiti e le dinamiche attraverso le quali esso esercita la sua azione tumorigenica.
Questo modello ci ha consentito di condurre le analisi nel contesto tissutale, preservandone tutte le caratteristiche distintive, e di evitare l’utilizzo di animali, come consigliato e auspicato dalle più recenti normative in ambito di sperimentazioni precliniche.
Attraverso questo approccio abbiamo potuto verificare la localizzazione tissutale e cellulare delle oncoproteine virali e l’accumulo di 53BP1 e γH2A.X nei siti di danno all’interno del nucleo delle cellule bersaglio.
Il saggio PLA ha permesso di rivelare per la prima volta l’interazione tra 53BP1 e, rispettivamente, E6 ed E7, ipotizzata sulla base delle loro sequenze amminoacidiche, ricche di leucine.
I risultati ottenuti con questa ricerca rinforzano il ruolo di E6 ed E7 nel controllo delle funzioni cellulari e arricchiscono le conoscenze riguardanti i meccanismi attraverso cui gli HPV promuovono la trasformazione neoplastica.
Solo conoscendo il ruolo e la versatilità di tutti gli attori in gioco sarà possibile ricercare ed attuare quanto prima delle strategie mirate di prevenzione e delle terapie ancora più efficaci.