Diletta Fontana
Le mutazioni di etnk1 inducono un fenotipo mutatore che può essere revertito con la fosfoetanolamina
La leucemia mieloide cronica atipica (aCML), rinominata sindrome mielodisplastica/mieloproliferativa con neutrofilia nel 2022 dall’Organizzazione Mondiale della Sanità, è una rara condizione ematologica maligna con incidenza di circa 1 caso per 1.000.000 di persone l’anno e un’età media all’esordio compresa tra i 60 e 76 anni. Questa patologia è caratterizzata da splenomegalia, leucocitosi neutrofila e moderata anemia. Ad oggi non sono disponibili terapie efficaci e la prognosi è estremamente severa con una sopravvivenza media di circa due anni dalla diagnosi.
Grazie all’utilizzo di tecnologie avanzate, come il sequenziamento dell’intero genoma, il nostro gruppo aveva identificato nel 2015 specifiche mutazioni a carico del gene ETNK1, che è coinvolto nell’insorgenza della aCML fin dalle sue fasi più precoci.
Con questo nuovo lavoro di ricerca è stato ricostruito il meccanismo oncogenico attraverso cui le mutazioni di ETNK1 causano l’insorgenza della leucemia. In particolare si è visto che queste mutazioni causano la riduzione dell’attività della proteina etanolamina chinasi, che è responsabile della fosforilazione dell’etanolamina, producendo fosfoetanolamina (P-Et).
Nei pazienti con mutazioni di ETNK1 si ha quindi una riduzione dei livelli intracellulari di P-Et. Per studiare il ruolo specifico di questo piccolo metabolita, abbiamo inserito le mutazioni di ETNK1 in un modello cellulare grazie alla tecnologia CRISPR/Cas9, e successivamente siamo andati a validare i risultati ottenuti direttamente nelle cellule dei pazienti. Nelle cellule con mutazioni di ETNK1 è presente un aumento significativo dell’attività mitocondriale, che viene revertito dopo la somministrazione di P-Et esogena, suggerendo un ruolo diretto della P-Et come regolatore negativo dell’attività mitocondriale.
Poiché la fosforilazione ossidativa è strettamente connessa alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), abbiamo studiato se l’aumentata attività mitocondriale potesse essere associata a una produzione anomala di ROS. In linea con la nostra ipotesi, è stato rilevato un aumento significativo della produzione di ROS nelle cellule con mutazioni di ETNK1, mentre il trattamento con P-Et è stato in grado di ripristinare al livello basale la quantità di ROS.
Dal momento che i ROS sono responsabili dell’insorgenza e della progressione di molti tumori, abbiamo controllato la comparsa di nuove mutazioni nelle cellule con ETNK1 mutato o WT, dimostrando un aumento significativo del numero di mutazioni nelle prime. Ancora una volta il trattamento con P-Et ha causato una reversione completa del fenotipo mutante nelle linee mutate, indicando come questo dipendesse dalla maggiore attività dei mitocondri.
Successivamente abbiamo studiato nel dettaglio l’attività mitocondriale isolando i singoli complessi dal I al IV e testando la loro attività in assenza/presenza di diverse concentrazioni di P-Et. Solo il complesso II, noto come succinato deidrogenasi (SDH), ha mostrato una diminuzione dose-dipendente della sua attività, suggerendo un ruolo per P-Et nel controllo dell’attività dei mitocondri attraverso l’inibizione diretta della SDH.
Analizzando poi l’attività del complesso II in saggi di competizione in presenza di P-Et e di concentrazioni crescenti di succinato, il substrato endogeno dell’SDH, abbiamo confermato che il succinato è in grado di ripristinare la normale attività del complesso II.
Questo risultato suggerisce quindi che P-Et agisce come un inibitore competitivo del succinato per l’attività della SDH. In linea con questi dati, il docking molecolare di P-Et e SDH ha dimostrato che P-Et può occupare il sito di legame del succinato in una conformazione energeticamente favorevole.
In conclusione abbiamo scoperto un nuovo meccanismo attraverso cui la ridotta attività di ETNK1, dovuta alle sue mutazioni, causa una riduzione della competizione tra P-Et e succinato.
Quest’ultima induce un aumento dell’attività mitocondriale e quindi della produzione di ROS, i quali sono responsabili dell’accumulo di ulteriori nuove mutazioni, che a loro volta inducono la progressione della malattia.
Questo studio suggerisce che il trattamento con P-Et può essere utile nel prevenire l’accumulo di mutazioni e quindi l’espansione clonale della malattia.