Gloria Griffante
La citrullinazione come strategia di evasione virale indotta da HCMV
Il citomegalovirus umano (HCMV), appartenente alla sottofamiglia beta degli Herspesvirus, infetta in modo latente una larga percentuale della popolazione umana, con una seroprevalenza inclusa tra il 50 ed il 90% a seconda delle condizioni socio-economiche e dell’area geografica. Pur trattandosi di una infezione spesso innocua nei soggetti sani, può portare a gravi conseguenze in individui con un sistema immunitario deficitario, come i pazienti trapiantati o i malati di AIDS. Inoltre, l’infezione congenita da HCMV è la causa più comune di malformazioni fetali e neonatali nei paesi sviluppati. Più recentemente, HCMV è stato associato allo sviluppo di malattie autoimmuni e degenerative, come l’aterosclerosi, malattie vascolari e l’invecchiamento cerebrale precoce, nonché ad alcuni tipi di tumori. La citrullinazione è una modifica post-traduzionale, catalizzata da enzimi appartenenti alla famiglia delle peptidil-arginin-deiminasi (PAD), che consiste nella conversione della peptidil-arginina in peptidil-citrullina. La deregolazione dell’attività delle PAD è associata a processi di natura infiammatoria, incluse alcune patologie autoimmuni, come l’artrite reumatoide, l’Alzheimer, il lupus eritematoso sistemico, la sclerosi multipla, o il Parkinson, e ad alcuni tipi di tumori.
Sulla base di queste premesse, e considerando che HCMV è in grado di indurre modifiche post-traduzionali di proteine cellulari per favorire la propria replicazione, l’oggetto del presente lavoro è stato di valutare per la prima volta l’impatto di HCMV sul processo di citrullinazione. Utilizzando fibroblasti umani primari (HFFs), abbiamo in effetti osservato che l’infezione da HCMV promuove la citrullinazione di diverse proteine cellulari, agendo direttamente sulle PAD, e che questo processo favorisce la fitness del virus stesso. Abbiamo dapprima analizzato il profilo di citrullinazione in corso di infezione da HCMV utilizzando due approcci diversi: una sonda fluorescente che riconosce specificamente i residui peptidici citrullinati, detta rodamina fenilgliossale o RhPG, e tramite western blotting con un anticorpo specifico diretto contro questi stessi residui. Abbiamo così inizialmente evidenziato che in fibroblasti umani infettati il numero di proteine citrullinate aumentava nel corso dell’infezione a 48 ore e poi calava a 96 ore post-infezione.
Valutando i livelli di mRNA e proteina, rispettivamente tramite analisi in RT-PCR e western blotting, abbiamo dimostrato che PAD2 e PAD4 sono le due isoforme indotte e implicate nel processo di citrullinazione indotto dal HCMV. Successivamente, al fine di verificare se la citrullinazione fosse un processo importante per il ciclo replicativo del virus stesso, abbiamo sfruttato dei composti di prima e seconda generazione che bloccano irreversibilmente l’attività di ciascuna PAD, detti Cl-amidina e BB-Cl-amidina, i quali si sono dimostrati efficaci nell’abbattere in modo significativo la replicazione di HCMV. Il fatto che la citrullinazione fosse cruciale per la replicazione di HCMV è stato inoltre confermato utilizzando delle linee HFFs knock-out (KO) per ciascuna isoforma di PAD, generate con la tecnologia CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/ Cas9. Tramite tale approccio tecnologico, abbiamo confermato che solo la deplezione genetica di PAD2 o PAD4 induceva una ridotta replicazione virale supportandone un loro specifico coinvolgimento. Infine, tramite esperimenti di spettrometria di massa, effettuati in collaborazione con il Dr. Paul Thompson (Dept of Biochemistry and Molecular Pharmacology, UMass Medical School, Worcester, MA, USA), abbiamo effettuato una dettagliata analisi del cosiddetto “citrullinoma” in corso di infezione, la quale ha evidenziato cambiamenti significativi nei livelli di deiminazione sia a livello di proteine cellulari che virali. In particolare, tra le proteine più modificate abbiamo evidenziato la presenza di elementi ad attività antivirale come IFIT1, una proteina interferon (IFN)-inducibile.
IFIT1 fa parte di una famiglia di proteine che legano l’RNA, coinvolte nell’attività antivirale principalmente contro i virus a RNA. Solo recentemente è emersa una loro implicazione anche nella risposta immunitaria innata contro virus a DNA, come il virus associato al sarcoma di Kaposi o KSHV (KSHV) e HCMV stesso. Poiché il silenziamento genico di IFIT1 aumenta la replicazione di HCMV, mentre la sua citrullinazione in vitro ne inibisce la capacità di legarsi al suo target specifico, il presente studio propone una nuova ipotesi secondo cui la citrullinazione di IFIT1 (indotta dal virus) rappresenterebbe un nuovo meccanismo di evasione del HCMV alla risposta antivirale della cellula ospite. In conclusione, le nostre scoperte rivelano il ruolo cruciale del processo di citrullinazione nella risposta cellulare all’infezione virale.