Alessandro Michienzi
ADAR1 limita la retrotrasposizione line-1
Per molti anni, il nostro gruppo di ricerca si è dedicato alla caratterizzazione della funzione degli enzimi cellulari appartenenti alla famiglia delle deaminasi ADAR (ADAR1, ADAR2 e ADAR3). Questi enzimi catalizzano reazioni di modifica delle sequenze di RNA a doppio filamento, convertendo specifiche adenosine in inosine (editing A-I), le quali vengono successivamente riconosciute come guanosine dai meccanismi cellulari. Tali eventi di editing possono determinare modifiche sia nella sequenza codificante degli RNA messaggeri, sia in sequenze non codificanti. Nel primo caso, potrebbero verificarsi cambiamenti amminoacidici nella proteina corrispondente, mentre nel secondo caso si possono osservare effetti sul metabolismo dell’RNA bersaglio, alterandone, ad esempio, la maturazione o la stabilità.
Il nostro laboratorio ha apportato un contributo significativo dimostrando che due enzimi ADAR, ADAR1 e ADAR2, rappresentano fattori cellulari cruciali che favoriscono la replicazione del virus HIV-1, sia attraverso meccanismi dipendenti che indipendenti dall’attività di editing. Successivamente, abbiamo caratterizzato il complesso proteico in cui queste due deaminasi sono coinvolte all’interno di cellule che esprimono i virioni di HIV-1. Sorprendentemente, molte delle proteine identificate nel complesso sono state precedentemente caratterizzate per il loro ruolo come inibitori dell’attività di retrotrasposizione degli elementi L1 o come componenti del loro complesso ribonucleoproteico.
Gli elementi L1 sono elementi genetici mobili che costituiscono il 17% delle sequenze nucleotidiche del nostro genoma e sono capaci di muoversi da una posizione genomica all’altra attraverso un meccanismo chiamato retrotrasposizione. Gran parte di questi elementi L1, durante l’evoluzione, sono stati mutati e resi inattivi, mentre una piccola percentuale (meno di 100 copie) rimane ancora integra e capace di spostarsi. Sebbene questi elementi mobili abbiano contribuito alla diversificazione del nostro genoma, potrebbero anche avere effetti deleteri inserendosi in sequenze del nostro DNA che svolgono funzioni cruciali nelle nostre cellule (geni), alterandole (mutazioni) o contribuendo all’instabilità genomica. Inoltre, l’accumulo di acidi nucleici derivati da questi elementi può attivare una risposta immunitaria innata aberrante e successivamente una risposta infiammatoria. Per questo motivo, nelle nostre cellule sono presenti diversi meccanismi di protezione dall’attività di questi elementi L1, che operano a diversi livelli prevenendo la loro espressione o inibendone la mobilità. La scoperta che molte proteine che fanno parte del complesso delle deaminasi ADAR1 e ADAR2 sono state precedentemente caratterizzate come fattori che interagiscono con componenti degli elementi L1 o che sono inibitori del loro processo di retrotrasposizione ci ha suggerito che questi enzimi potessero anch’essi essere dei fattori di restrizione della mobilità di questi elementi genetici.
Per verificare questa ipotesi, abbiamo condotto degli esperimenti in vitro utilizzando cassette plasmidiche contenenti elementi L1 completi, la cui mobilità può essere misurata con varie metodiche (fluorescenza o resistenza agli antibiotici). Attraverso queste cassette, abbiamo dimostrato che in linee cellulari in cui l’espressione della deaminasi ADAR1 è stata fortemente ridotta, il processo di retrotrasposizione L1 è invece fortemente favorito. Al contrario, in esperimenti in cui la proteina ADAR1 è sovraespressa, si osserva una forte riduzione della mobilità del retrotrasposone. Questi esperimenti suggeriscono che ADAR1 è un inibitore della mobilità degli elementi L1. Per verificare se la soppressione della mobilità degli elementi L1 fosse dipendente dall’attività di editing dell’enzima, abbiamo sovraespresso la proteina ADAR1 o un suo mutante privo del dominio catalitico responsabile dell’attività di editing. Abbiamo verificato che la capacità di entrambi nel’inibire la retrotrasposizione è sovrapponibile, provando, quindi, che l’attività di editing non è necessaria. Questo risultato è stato poi confermato dall’analisi degli RNA prodotti dall’elemento L1 che, in presenza dell’enzima ADAR1, non hanno evidenziato la presenza di eventi di editing di specifiche adenosine.
Successivamente, abbiamo dimostrato che ADAR1 interagisce con componenti ad RNA e proteine del retrotrasposone L1. I nostri risultati evidenziano chiaramente che ADAR1 è un inibitore del processo di retrotrasposizione, probabilmente con un meccanismo indipendente dall’editing, attraverso l’interazione con alcune componenti dello stesso retrotrasposone, suggerendo così un meccanismo di inibizione della mobilità di questi elementi.