Virginia Veronica Visconti
Effetto in cis degli alleli espansi dmpk con interruzioni non-ctg nei pazienti con distrofia miotonica di tipo 1
La distrofia miotonica di tipo 1 (DM1) è una malattia multisistemica autosomica dominante causata da un’espansione del tratto CTG nella regione non tradotta (UTR) del gene DMPK. Gli alleli DM1 contenenti ripetizioni varianti non-CTG alle estremità 3′ e 5′ della ripetizione CTG sono stati descritti in circa il 3-11% dei pazienti DM1, con conseguenze molecolari e cliniche incerte. Il tratto di ripetizione CTG è localizzato in un’isola CpG di 3,5 kb, e fiancheggiato da due siti di binding della proteina isolante CTCF, denominati CTCF1 e CTCF2. Il legame di CTCF è metilazione-sensibile e si suppone che stabilisca un elemento isolante insieme alle ripetizioni CTG e alla regione enhancer di SIX Homeobox 5 (SIX5). Diversi studi hanno esaminato la relazione tra il livello di metilazione del locus DM1 e la presenza di questi alleli contenenti ripetizioni varianti non-CTG, mostrando effetti in cis variabili delle interruzioni non-CTG. L’importanza di definire una firma di metilazione è evidenziata dalla stabilità nel tempo dei livelli di metilazione del DNA a monte e a valle delle ripetizioni CTG, indicando il potenziale utilizzo di questo meccanismo epigenetico come biomarcatore di malattia. Il nostro studio si propone di approfondire l’associazione tra la presenza di alleli DMPK espansi contenenti ripetizioni varianti non-CTG in entrambi i lati dell’array CTG e il pattern di metilazione del locus DM1 in una coorte di 20 pazienti DM1.
Il livello di metilazione delle due isole CpG che fiancheggiano l’espansione DM1 è stato analizzato e correlato con la struttura, la lunghezza e l’origine parentale degli alleli DMPK varianti. Il presente studio ha arruolato un gruppo di 20 pazienti con DM1 provenienti da famiglie italiane che si sono rivolte all’Unità di Genetica Medica del Policlinico Tor Vergata per l’esecuzione di test genetici per la DM1 nel periodo compreso tra il 2007 e il 2021. Tutti i pazienti sono stati sottoposti valutazione clinica, esami neurologici, oftalmologici, cardiaci e di laboratorio. La mutazione DM1 è stata caratterizzata utilizzando una combinazione di short-range PCR (SR-PCR), triplet repeat primed PCR (TP-PCR) e long-range PCR (LR-PCR). Venti pazienti DM1 portatori di alleli espansi DMPK “puri”, tra cui tre pazienti con DM congenita (CDM), sono stati inclusi in questo studio come controlli per l’analisi dei livelli di metilazione del locus DM1. Le interruzioni dell’array CTG sono state rilevate con TP-PCR modificata bidirezionale seguita da elettroforesi capillare. I motivi non-CTG sono stati confermati dal sequenziamento Sanger. Il pattern di metilazione del locus DM1, che comprendeva un’isola CpG, con 10 siti CpG, situata all’estremità 5′ delle ripetizioni CTG e un’isola CpG, con 6 siti CpG, all’estremità 3′ delle ripetizioni CTG, è stato determinato mediante pirosequenziamento. Abbiamo caratterizzato 7 pazienti contenenti ripetizioni varianti non-CTG all’interno del tratto CTG all’estremità 5′ e 13 pazienti portatori di sequenze non- CTG all’estremità 3′ dell’espansione DM1.
Sono stati identificati i seguenti motivi: CCG, CCGCTG, CTC, TTG, CGG e CCGCTGCTG. Abbiamo osservato una maggiore variabilità nella composizione degli alleli varianti all’estremità 3′, rispetto a quelli all’estremità 5′ del tratto espanso CTG. Il motivo CCG era il più ricorrente sia negli alleli interrotti in 5′ che in quelli in 3′, con una frequenza rispettivamente del 57,1% e del 92,3%. Complessivamente, i pazienti con interruzione dell’estremità 3′ hanno mostrato una percentuale maggiore di sequenza variante, raggiungendo il 31,6% dell’intero tratto ripetuto espanso. Per valutare se la presenza degli alleli varianti precedentemente caratterizzati potesse modulare il pattern di metilazione del DMPK, è stata eseguita un’analisi della metilazione CpG nella nostra coorte di pazienti DM1. Gli alleli DMPK con alleli varianti all’estremità 5′ o 3′ erano invariabilmente ipometilati a monte dell’espansione CTG. È interessante notare che i pazienti DM1 con alleli varianti all’estremità 3′ hanno mostrato livelli di metilazione più elevati nell’isola a valle del tratto ripetuto CTG, preferenzialmente quando l’allele espanso era ereditato per via materna. Lo studio ha contribuito ad ampliare le conoscenze sulla variabilità genetica ed epigenetica del locus DMPK nei pazienti DM1 portatori di motivi di interruzioni non-CTG.
Lo studio, anche se basato su approcci base di PCR, ha ampliato le conoscenze sulla variabilità genetica ed epigenetica del locus DMPK nei pazienti DM1 portatori di diversi motivi di interruzioni non-CTG. I nostri risultati suggeriscono una potenziale correlazione tra gli alleli varianti, l’origine parentale della mutazione e il pattern di metilazione degli alleli espansi del gene DMPK. Uno stato di metilazione CpG differenziale potrebbe effettivamente svolgere un ruolo nella variabilità fenotipica dei pazienti DM1 con alleli varianti, rappresentando un utile strumento diagnostico.